Никогда такого не писал, но ситуация вынуждает:
Срочно нужна ячейка детектора на хроматограф Милихром 6. Детектор спектрофотометрический на УФ-область. Знаю, что во многих лабораториях они стоят списанные. Может, у кого-то лежит без дела такой прибор? Территориально я нахожусь в северном казахстане, ближайший российский город- Омск.
Буду признателен за помощь, оплату гарантирую
Вот такая ячейка нужна
Для ЛЛ: есть. Но очень мало, меньше, чем в квасе.
Заказал на Ozon чайный гриб. Захотелось вспомнить вкус - когда-то было до дюжины банок, пили всей семьёй. Правда, вместо пластины нормального диаметра приехал кружочек с полладони размером, но удивительная живучесть этого симбиотического организма сделала своё дело; вот как этот красавец выглядит спустя месяц:
![Есть ли спирт в настое чайного гриба? [газовая хроматография] Химия, Эксперимент, Наука, Хроматография, Чайный гриб, Научпоп, Алкоголь, Этиловый спирт, Анализ, Длиннопост](https://cs13.pikabu.ru/post_img/2023/03/08/5/167825786211780278.jpg)
Он смотрел бы тебе прямо в душу... если бы у него были глаза.
Отнёс немного с "первого урожая" на работу, угостить коллег. Распробовали - и началось: оно ведь бродит, а спирт там есть? А сколько? А за руль можно? Стали гуглить, читать статьи - но зачем гадать, если в лаборатории есть газовый хроматограф! Кстати, собственно, вот он:
![Есть ли спирт в настое чайного гриба? [газовая хроматография] Химия, Эксперимент, Наука, Хроматография, Чайный гриб, Научпоп, Алкоголь, Этиловый спирт, Анализ, Длиннопост](https://cs13.pikabu.ru/post_img/2023/02/20/8/1676899331135518529.jpg)
О том, что это такое и как оно работает, замечательно написал уважаемый @Grum25 вот здесь. В двух словах: анализируется проба и параллельно с ней - раствор, содержащий определяемое вещество (в данном случае - этиловый спирт) в известной концентрации. Прибор выдаёт график - так называемую хроматограмму. На ней есть пики, соответствующие отдельным веществам. Связанная с прибором программа вычисляет площадь этих пиков, а уже по этой ней находим собственно содержание. К счастью, в тот день как раз нужно было определить содержание этанола в предъявленном для анализа образце, к которому легко было подставить дополнительную пробу. И вот так выглядят наложенные друг на друга хроматограммы настоя чайного гриба и стандартного раствора этилового спирта:
![Есть ли спирт в настое чайного гриба? [газовая хроматография] Химия, Эксперимент, Наука, Хроматография, Чайный гриб, Научпоп, Алкоголь, Этиловый спирт, Анализ, Длиннопост](https://cs14.pikabu.ru/post_img/2023/02/20/7/1676891694155166920.jpg)
Опущу описание пробоподготовки и вывод формулы для расчёта; результат (площадь измеряется в пикоампер*секунду):
![Есть ли спирт в настое чайного гриба? [газовая хроматография] Химия, Эксперимент, Наука, Хроматография, Чайный гриб, Научпоп, Алкоголь, Этиловый спирт, Анализ, Длиннопост](https://cs13.pikabu.ru/post_img/2023/02/20/8/1676899368134846030.jpg)
Всего лишь 0,14%! Для сравнения, в квасе допускается содержание этилового спирта до 1,2% - почти в десять раз больше.
Вывод: за руль садиться можно, детям наливать тоже. Но надо учитывать, что чёткой рецептуры приготовления никто не придерживается, количество заварки и сахара, как и время выдержки, варьируются в очень широких пределах. Сам гриб тоже может быть старше или моложе - всё это повлияет на результат.
Я работаю с Кристаллами 5000.2, у нас 2 детектора ПИД и 2 ДТП, газовая хроматография, в приборе 3 колонки, 2 составные насадочные и одна капиллярная, и в составе имеем метанатор. Сорбенты колонок: на ДТП 2 молекулярные сита, ДТП1 - карбоксен, каппилярка-парапак Q. Это была присказка, начинается сказка. По газовой схеме, проба, пройдя через карбоксен и зарегистрировавшись на ДТП1, уходит на метанатор, после чего заходит на ПИД2. В прошлом году у нас сдох метанатор, мы его благополучно регенерировали, на ПИДе все отлично, НО!!!! После регенерации на ДТП1 площадь пика СО2 села в 2 раза!!!! Как, скажите, как ДТП1 связан с метанатором???? Этот детектор стоит ПЕРЕД метанатором, загадка😢
Приветствую всех, кто имеет отношение к хроматографии и/или интересуется этой темой. Сегодня будет короткий рассказ об устройстве и принципах работы газовых хроматографов (ГХ). Думаю, это будет полезно тем, кто только начинает свой путь в хроматографии или, в силу обстоятельств, раньше работал с другими типами хроматографов. Изучать этот вопрос мы будем на примере газового хроматографа фирмы Agilent, модели 7890B. Это прибор, имеющий автосамплер (устройство автоматического ввода пробы) и ПИД- детектор (пламенно-ионизационный детектор). Описывать принцип работы буду своими словами, чтобы не перегружать текст лишними терминами
Газовый хроматограф представляет собой аналитический прибор, с помощью которого осуществляется определение количественного состава смеси веществ, доведенных до газообразного состояния путём нагрева пробы. Исследуемое вещество может быть жидким, газообразным или твёрдым. В данном случае проба находится в виде раствора.
Кратко коснусь истории создания ГХ. Как известно, русский ученый Цвет М.С., открывший метод разделения веществ, названный впоследствии хроматографией, использовал в своих опытах исследуемые вещества и вещества-носители в жидком состоянии. Но, в силу технических трудностей, связанных с отсутствием хороших сорбентов, способ жидкостной хроматографии (ЖХ) долгое время не получал распространения, вплоть до 60-хх годов 20 века. С газовой хроматографией дело обстояло несколько иначе- появившись позже, этот способ разделения и исследования в-вв, получил билет в жизнь уже в конце 40-х годов. Это связано с более простым, нежели в ЖХ, устройством колонки и отсутствием необходимости подбора универсального сорбента, способного осаживать на себе большой спектр веществ. Такой вот поворот судьбы- изобретенные позднее, чем ЖХ, газовые хроматографы появились и стали использоваться в аналитической химии гораздо раньше своих жидкостных собратьев.
Теперь про устройство ГХ. Прибор, как правило, состоит из нескольких блоков: Блок подготовки газов, он-же регулятор расхода газов, Блок ввода пробы, термостата с колонкой и детектора.
Начнём с носителя. В качестве газа-носителя могут использоваться многие газы, такие, как аргон, азот, гелий, водород и другие. В зависимости от конкретных условий лаборатории, в качестве источника газа-носителя используют генераторы газов либо сжатый газ в баллонах.
Ниже на фото показан воздушный компрессор с встроенным генератором азота. Использование подобного генератора избавляет от необходимости перевозки и хранения в лаборатории громоздких баллонов.
Для хроматографа с ПИД- детектором, кроме газа-носителя, необходимы еще сжатый воздух и водород. Они используются в качестве топлива для горелки. Источником сжатого воздуха служит компрессор, а для получения чистого водорода применяется генератор водорода, работающий по принципу разложения воды путем электролиза:
Газы подаются в ГХ через специальный регулятор потока газов, с помощью которого устанавливаются требуемые расход и давление. Регуляторы бывают как электронные, встроенные в хроматограф и регулируемые путём изменения параметров через программное обеспечение (ПО) хроматографа, так и механические, где регулировка производится вручную с помощью мембранного регулятора. Регуляторами последнего типа оснащаются, как правило, недорогие модели хроматографов.
С газами разобрались, теперь переходим к устройству автоматического ввода пробы, автосамплеру. Виалы (небольшие флаконы с крышкой, имеющей мягкую резиновую мембрану, протыкаемую иглой при отборе требуемого количества пробы) с разведенными растворителем пробами устанавливаются в специальную кассету, имеющую гнёзда.
В данном случае это кассета карусельного типа на 16 виал для проб + 3 виалы для промывочных растворителей.
Из виалы проба отбирается специальным шприцем, имеющим объём от 1 до нескольких микролитров, после чего, с помощью того-же шприца, проба вводится в испаритель. Для герметизации испарителя устанавливается резиновая мембрана, которую называют септой.
Испаритель служит для приведения жидкой пробы в газообразное состояние и смешение полученного пара с газом-носителем, после чего полученная смесь проходит через делитель потока, который направляет некоторую её часть в колонку, а остальное сбрасывает в атмосферу. Для лучшего смешивания в испарителе присутствует лайнер, представляющий собой полую трубку. Лайнер может быть заполнен стекловатой или стеклянными шариками.
Картинка честно стырена на просторах интернета:
Теперь про неподвижную фазу хроматографической системы- колонку. Колонок для газовой хроматографии существует великое множество, я выделю из них только насадочные и капиллярные. Насадочные колонки представляют собой полую трубку достаточно большого диаметра (2-5 мм), заполненную сорбентом. Длина такой колонки обычно не превышает 2-3 метров. Капиллярные колонки тоже изготовлены из стеклянной или кварцевой трубки, но диаметр её намного меньше (от 0.05 до 0.5мм), зато длина гораздо больше, несколько десятков метров (обычно 20-50м). Внутренняя поверность такой колонки покрыта тонким слоем специального полимера, с помощью которого и происходит осаждение и разделение веществ, содержащихся в пробе.
Колонка помещается в термостат- изолированный от внешней среды отсек, в котором, с помощью нагревательных элементов, поддерживается температура, необходимая для эффективного разделения веществ, содержащихся в пробе. Обычно это 150-300°С.
Вот мы и подобрались к одному из самых важных элементов хроматографа- детектору. Данный хроматограф оснащён пламенно-ионизационным детектором, ПИД, его устройство в кратце и рассмотрим. Я не буду расписывать все типы детекторов (а их не один десяток), каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, это отдельная большая тема.
ПИД состоит из горелки и высокочувствительного амперметра, регистрирующего изменение силы тока между коллекторным электродом и корпусом горелки. ( В некоторых ПИД используются 2 изолированных электрода).
Газ-носитель с исследуемым веществом, выходя из колонки, смешивается с водородом (и воздухом, необходимым для устойчивого горения). Полученная смесь попадает в форсунку горелки, в которой поддерживается пламя. Ионизируясь в этом пламени, смесь газов уменьшает электрическое сопротивление между электродами, что приводит к увеличению силы тока, которое измеряется точным амперметром. Далее, сигнал амперметра преобразуется микроконтроллером и подаётся на ПК для дальнейшей обработки. Программное обеспечение, на основании этого сигнала, и рисует график, состоящий из нулевой(базовой) линии и пиков, соответствующих количественному составу исследуемых веществ.
Устала бодаться с Хроматэком, у нас газовая хроматография. Последние Кристаллы собраны из говна и палок, сорбенты гавно, детекторы не пашут, метанатор регенерировали уже через полгода
Здрасьте здесь! Этот пост – сборная солянка. Я начал писать про ремонт реакционного модуля, но в процессе захотелось еще и объяснить, что это, для чего и как работает. Надеюсь, пост не будет утомительным.
И у меня есть свой реактор. Он, конечно, не ядреный и не такой большой и не такой теплый (и не ламповый), но выполняет весьма важную и нужную функцию.
Более официально он называется «реакционный модуль» и единственная его задача – смешать поток аналита с потоком дериватизатора, чтобы мы могли «увидеть» аналит на детекторе. Сейчас расскажу всё настолько подробно, насколько сам то разумею.
Как я уже писал в предыдущем посте про спектрофотометрические детекторы, чтобы увидеть аналит на хроматограмме, необходимо, чтобы он как-то взаимодействовал со светом или ультрафиолетовым излучением. Но не всегда вещество свет или УФ поглощает. Точнее – не «или», а «и». Есть аналиты, которые на спектрофотометрическом детекторе не видны и у нас, по сути, два пути: найти такой детектор, который сделает вещество видимым (например, флуориметрический, рефрактометрический и т. д.), либо сделать что-то с веществом, чтобы оно изменило свои свойства, но при этом не сильно повлиять на способность хроматографической колонки исследуемые вещества определять.
Такое действие – превращение вещества в видимую (детектируемую) форму, называется «дериватизация», а вещество, получающееся в результате – дериватом. Дериват обладает несколько иными свойствами, чем исходное вещество, а в некоторых случаях и вовсе самим веществом не является.
Аминокислоты (точнее, их натриевые соли, потому что в процессе подготовки пробы к анализу она на одном из этапов нейтрализуется гидроксидом натрия) практически невозможно увидеть на спектрофотометрическом детекторе в чистом виде, поэтому их «проявляют». Есть несколько способов такой «проявки», например, дериватизация аминокислот фенилизотиоцианатом (ФИТЦ). В этом варианте аминокислоты сначала дериватизируют, а уже после разделяют на обращенной фазе.
В нашем случае мы используем более классический способ – дериватизацию нингидрином уже после разделения аминокислот на катионообменной колонке. Это вполне себе ГОСТовый способ, известный давно и хорошо работающий, правда, не без недостатков.
Итак, нам нужны уже разделенные на колонке аминокислоты и нингидрин, поток которого мы будем добавлять в поток подвижной фазы, несущей аминокислоты в детектор. Для этого и служит наш реакционный модуль.
Внутри он достаточно прост:
Слева направо:
вентилятор на радиаторе охлаждения
термоблок, где происходит, собственно, дериватизация при температуре 110 градусов
контроллер, управляющий всей этой системой
блок насоса (синий), чуть ниже – клапаны переключения потоков и собственно панель управления
Да, стоит отметить, что это российская разработка одной российской компании, хотя и с множеством иностранных комплектующих.
Почему и зачем он находится в открытом виде? Потому что фото сделано в процессе ремонта, а точнее – замены длинного реакционного капилляра. Его длина около 8 метров и намотан он на небольшую шпулю, погруженную в силиконовое масло. И всё это находится в термоблоке, разогревающемся до 110 градусов.
Сам термоблок крупным планом (надпись сделал я, чтобы не перепутать в процессе ремонта, откуда капилляр выходит на детектор):
А это 8 метров плотно упакованного капилляра (здесь он уже снят со шпули):
Это засорившийся капилляр, из-за чего насосы не могли прокачать его и давление в системе росло до критического, после чего и реакционный модуль, и насос хроматографической системы отключались.
Точно такой же, но новый, был намотан и установлен в термоблок. После чего в тестовом режиме через него я прокачал несколько миллилитров изопропанола, подключил ВЭЖХ и воспроизвел работу в режиме разделения. Но конец капилляра, который обычно идет в детектор, на этот раз остался свободным. Итак, с конца капает капля...
Значит, система живет и функционирует нормально. Теперь вернемся к тому, что она делает.
Готовый к работе нингидрин выглядит так:
А так выглядит набор уже готовых буферов и промывок, которые приезжают к нам в готовом виде, поскольку заморачиваться с самостоятельным приготовлением уже как-то лень.
Иногда приходящие ко мне в лабораторию сторонние люди посмеиваются над этой фольгой, но, надо сказать, ничего проще и удобнее пока не придумано.
Что происходит: с колонки идет поток подвижной фазы, несущей уже разделенные (надеемся, что разделенные) аминокислоты. Реакционный модуль добавляет в этот поток нингидрин и отправляет в термоблок, где при нагревании реакция дериватизации проходит достаточно быстро.
Сам механизм этой реакции выглядит в упрощенном виде так:
Собственно, молекула нингидрина, связываясь с альфа-аминогруппой аминокислоты, после отщепления радикала R сама становится амином и присоединяет вторую молекулу нингидрина, в результате чего получается конечный продукт реакции – комплекс Рауэмана, имеющий в случае альфа-аминокислот ярко-синюю окраску и, что гораздо важнее, поглощающий в результате свет. Наиболее интенсивно это происходит на длине волны 570 нм.
На такой длине мы и ловим спектрофотометрическим детектором аминокислоты. Но более правильно будет сказать –комплекс Рауэмана, поскольку самой аминокислоты уже нет. Но так как реакция происходит количественно (одно и то же количество аминокислоты всегда дает одно и то же количество комплекса, а, следовательно, всегда одну и ту же интенсивность окращивания), то мы можем не только отметить наличие комплекса в потоке элюента, но и посчитать его концентрацию. Следовательно, мы можем посчитать и концентрацию аминокислоты (обычно в ммоль/мл, поскольку стандарт поставляется именно в такой размерности концентрации).
В случае таких аминокислот, как пролby и гидроксипролин, альфа-аминогруппа отсутствует, но комплекс образуется, однако уже другой, с желтоватой окраской и поглощает уже на длине волны 440 нм (наиболее интенсивно, конечно). Поэтому на практике детектирование ведется сразу на двух длинах волн (точнее, эти длины вычленяются из всего регистрируемого спектра).
Хроматограмма смеси аминокислот (в данном случае смеси стандартов аминокислот, по которому мы строим градуировки) выглядит так:
Можно увидеть, что это длина волны поглощения 570 нм.
Нингидрин «проявляет» не только аминокислоты, но и всё, что содержит аминогруппу. Так. он легко проявляет пептиды и белки. Если нингидрин попадает на кожу, она становится такой:
Окрашивание появляется не сразу, но остается на несколько дней. Такая реакция позволяет применять нингидрин в криминалистике, где распылением его раствора можно проявлять отпечатки пальцев на пористых поверхностях, например, на бумаге (и, что характерно, я это делал, но фотографию результата найти не смог).
После окончания работы реакционный модуль промывается смесью из воды, метанола и изопропанола в соотношении 50 : 25 : 25. Иначе нингидрин забьет капилляры, с чего, собственно, и начался этот пост (моя сотрудница забыла промыть реактор).
И на этом можно заканчивать и уходить домой. Спасибо всем, кто дочитал.
Собственно, поймали меня за язык в комментариях к предыдущему посту, деваться некуда, придётся писать )
ACHTUNG! Огромная простыня получилась. Если что, я предупреждал
Про себя особо рассказывать не буду, ибо пост этот не тщеславия ради, а просвещения для. Если коротко, то последние 7 лет своей жизни занимаюсь я, возможно, самой крутой вещью на этом глобусе - делаю лекарства.
Притом лекарства не такие, которые у всех на слуху, типа аспирина там какого-то банального. Нет, про эти препараты большинство людей просто не слышали и в аптеке их не купить, однако они позволяют лечить болезни, которые ещё десяток-два-три лет назад звучали как приговор. Имя этому классу препаратов - моноклональные антитела.
Was ist das?
Разберёмся поподробнее с самим названием. Антитела - это особые белки, вырабатываемые организмом для защиты от чужеродных агентов. Если сильно упростить, то структура антитела похожа на букву Y. Макушки этого игрека будут обладать уникальным свойством опознавать определённую структуру (будь-то какой-то белок бактерии, вируса и т.п.), называемую антигеном, в то время как "ручка" у вообще всех антител (в пределах одного класса, но об этом не здесь) одинаковая. Узнаваемость антигена антителом штука очень специфическая - антителу нужна совершенно конкретная молекула с совершенно конкретной конформацией, всё остальное его не колышет. Никак.
"Ручка" же нужна, в основном для того, чтобы сообщить другим компонентам иммунной системы, что супостат обнаружен и надо с ним что-то делать. Да, ручка по-заумному называется Fc - Fragment crystallizable. Т.к. они у всех антител одинаковые - из них можно вырастить кристалл, потому и кристаллизуемый. А переменная часть именуется Fab - Fragment antigen-binding, тобишь, антиген-связывающий.
Собственно, моноклональные антитела, по сути своей, такие же антитела, только искусственные, в отличие от тех, что содержатся в сыворотке крови (а там их содержится превеликое множество самых разных), эти все как на подбор - одинаковые, произошедшие от одного единственного клона. Потому и моноклональные. Текущий уровень развития технологий позволяет целенаправленно конструировать антитела против конкретных молекулярных мишеней. Так что если мы понимаем, что происходит при той или иной болезни, мы можем придумать для этого антитело.
Существует несколько сценариев использования антител при терапии.
Можно использовать "голое" антитело по его прямому назначению (активация иммунного ответа против мишени, на которую нацелено антитело, например, ритуксимаб), либо, например, использовать антитело в качестве самонаводящейся пули, которая может притащить к раковой клетке немного радиоактивного изотопа (аки террорист-смертник, обвешанный гранатами с выдернутой чекой, ибритумомаб), либо, используя свойство антител связываться с антигеном, просто вырубить какую-нибудь сигнальную цепь в организме (например, вырубив весь наличный IL-6, можно задавить воспалительный процесс при ревматоидном артрите - олокизумаб).
Из приведённых названий антител выделяется окончание -маб. В общем-то, Monoclonal antibody оно и означает. Так что если вы видите непатентованное название (МНН) оканчивающееся на -маб, то знайте - это оно. Лечат ими в основном онкологию, автоимунные заболевания, типа волчанки, ревматоидного артрита и некоторые орфанные заболевания (это те, случаев которых известно пару сотен штук на весь мир, типа болезни Шницлера).
Wie wird's gemacht?
Ну бумага-то стерпит любую писанину. Как сделать-то их? Как вообще лекарства делают? Ну вот, например, такая молекулка...
Знакомьтесь, это парацетамол... В общем-то, практически любой студент-второкурсник с химфака нарисует вам цепочку синтеза этой штуки из широко доступного сырья. Будет там 5-6 стадий. Но в случае с мабами такой подход не прокатит - их молекулы состоят из пары сотен отдельных мономерных звеньев (всего их в белках встречается 20 различных), чередование которых, при этом ещё и нерегулярное. Какой суммарный выход будет у процесса, который включает в себя 200 стадий? Но ведь наши клетки их как-то делают? Хм... клетки... а давайте заставим клетки нарабатывать нужный нам белок! Вот мы и пришли к такой штуке, как биотехнология. Берём какую-нибудь клеточную линию, которую можно без проблем и сильных танцев с бубном выращивать в промышленных масштабах и программируем на производство нашего белка (а это уже генетическая инженерия. Звучит как фантастика, но, на самом деле, давным-давно весьма рутинная операция) и получаем...
А получаем мы пару-тройку тонн коричневой жижи с запахом ношеных недели три носков, которая никак не похожа на ту чудесную панацею, про которую я тут уже столько слов написал. Нужно как-то зёрна отделить от плевел. Вот тут-то и наступает черёд хроматографии.
Что же представляет собой эта дурно пахнущая жижа? Ну... питательная среда, на которой растили клетки, сами клетки, подохшие клетки, ошмётки подохших клеток, продукты жизнедеятельности клеток и... целевой продукт. Целевого продукта, дабы осознавать масштаб проблемы, будет граммов 5 на литр (это считается, на самом деле, очень неплохой продуктивностью). При производстве моноклональных антител в подавляющем большинстве случаев используются клеточные линии на основе CHO - клетки яичника китайского хомячка (Chineese Hamster Ovary, собственно). У них есть несколько ключевых преимуществ - растут в суспензионной культуре (жбан с жижей, в котором плавают клетки. Адгезионные культуры, в противоположность, могут расти только слоем на подложке-матрасике), выделяют целевой продукт в окружающую среду (не надо разрушать клетки - меньше мусора на очистку), дают белок, не отличимый от "родного" (правильный фолдинг и пострансляционные модификации - бактерии и дрожжи так не умеют, хотя продуктивность у них сильно больше). Ну, поскольку продукт у нас находится в растворённом виде и имеет нанометровые размеры, а клетки - это довольно жирные колобки в пару десятков микрон диаметром, логичный первый этап - избавиться от них. Сделать это можно либо фильтрацией, либо центрифугированием. Применяются оба подхода, причём, чем больше масштаб, тем сильнее предпочтение в пользу центрифугирования. В любом случае, эту часть процесса называют осветление или Clarification - жижа из мутной становится прозрачной, однако носкаином от неё разит всё ещё нехило. Мы с ребятами прикидывали, что в двухкубовом реакторе под конец культивирования полощется пара-тройка десятков килограммов биомассы (ну и около 10кг растворённого белка, если продуктивность 5г/л). Надо понимать, что не всякий фильтр не спасует перед таким вызовом (при условии приемлемой площади). Чаще всего применяют глубинные фильтры (примерно как песчаные фильтры на водоканале) на основе диатомита и целлюлозы - клетки и прочий крупный мусор застревают между волокон. Это оптимальное с точки зрения грязеёмкости на единицу площади решение. Выглядят они примерно вот так (насос, подающий и приёмные жбаны не показаны)
Ну, от клеток мы избавились. Теперь нужно как-то выделить сами антитела. Осложняется задача тем, что продукт - далеко не единственный белок в растворе. Тут вам и белки из подохших и развалившихся клеток (вот почему предпочтительно клетки не разрушать), компоненты питательной среды (там тоже и отдельные аминокислоты и короткие пептидные фрагменты) и ещё чёрта лысого только нет (хотя, если хорошо поискать...). И тут нам на помощь приходит аффинная хроматография. Суть её заключается в очень специфическом взаимодействии между продуктом и материалом неподвижной фазы. Собственно, всё очень просто: прогоняем жижу через колонку с нашим чудо-веществом, продукт к нему прилипает, а всё остальное утекает в канализацию на станцию деактивации стоков. Метод беспроигрышный, инфа сотка! Где только взять это чудо-вещество? Ну, тут есть несколько довольно распространённых подходов. Например, можно в последовательность ДНК, кодирующую целевой белок, зашить код нескольких подряд гистидинов в виде хвостика (т.н. His-tag) и потом за этот хвостик вытягивать белок при помощи металл-ионной аффинной хроматографии (Ni-IMAC, например... Ni-Ion Metal Affinity Chromatography, смыть связавшийся продукт можно похожей на гистидин молекулой - имидазолом). Проблема в том, чтобы потом убрать этот хвостик (который сам по себе действует на иммунную систему пациента как красная тряпка на быка) и никель (аллерген), но если другого выхода нет, то пользуют. Однако, в случае с антителами другой подход есть. Есть такая бактерия... Staphylococcus aureus, золотистый стафилококк. Живёт на коже, не особо полезная, но, если с иммунитетом норм, то проблем не доставляет. И есть у этой мелкой дряни белок, называемый белком А (Protein A, ProA). И есть у этого белка одна интересная способность - связываться с любыми антителами (товарищи зануды, мы говорим только про IgG, если что. Мы вроде как научпопом занимаемся, поэтому некоторые допущения и приближения вполне допустимы). Без разницы на последовательность Fab, так как связывание происходит с Fc (а он, напомним, одинаковый). Связывание зависит от кислотности среды - при околонейтральном pH (6,5 - 7,5 чаще всего) происходит образование комплексов белокА - антитело, а при подкислении до около 3,5-3,7 - распад. Ну, осталось только взять этот белок А, пришить его крепко-накрепко к какой-нибудь матрице (чаще всего это сефароза, по сути, маленькие, но очень пористые мармеладные шарики диаметром около 90 микрон), чтобы никуда не делся. Это и есть наша стационарная фаза - при пропускании содержащего продукт раствора, торчащие в стороны молекулы белка А будут вылавливать молекулы антител. Чтобы она была действительно стационарной, поместим её в стеклянный или акриловый цилиндр, с двух сторон ограниченный сетками, чтобы никуда эти мармеладные шарики не делись. Это уже хроматографическая колонка. Размеров они бывают разных. В лаборатории при разработке техпроцесса обычно используют диаметром от 5мм до 50мм. При масштабировании до пилотного производства - 100-200мм, а при полномасштабном бывают и больше метра. Одно остаётся постоянным - высота слоя стационарной фазы. Она обычно бывает не больше 20см, так что промышленная колонка даже не колонка, а, скорее, блинчик. Вот так вот выглядит пустое чудовище диаметром 800мм. Весит такой девайс порядка 2 тонн. Пустой. Объём такой колоночки может быть влёгкую 100-120 литров (все аналитики от таких цифр тихо ахнули)
В зависимости от марки сорбента (стационарной фазы), один литр колонки может связать 40-80 граммов антител. То что связывание происходит через Fc делает метод универсальным - не важно какой препарат вы чистите, это может быть даже не антитело, а какой-нибудь fusion-protein, у которого от антитела только "ручка", в любом случае вы будете использовать аффинную хроматографию с белком А.
А вот так выглядит колоночка диаметром 26мм. Такие используются в лабораториях при разработке процесса
Для того, чтобы пропускать различные растворы с заданными параметрами (нас интересуют, прежде всего, объём и скорость), используются хроматографы. Размерами они бывают от настольных лабораторных (до 150-600 мл/мин), до здоровенных промышленных шкафов, качающих больше 20 литров в минуту. По сути, хроматограф - это насос, клапанная обвязка входа (выбор раствора/продукта), клапанная обвязка колонки (можно пустить поток в обе стороны, либо мимо колонки), блок детекторов (мониторинг параметров - проводимость раствора/солёность, pH, оптическая плотность, температура и т.д.) и клапанная обвязка выхода (слив, либо сбор продукта) и кучка манометров, стоящих в разных местах системы. Выглядеть может как-то так (слева - äkta Pure - до 150мл/мин, в середине - äkta Pilot до 600мл/мин, справа - äkta Ready - до 500 л/ч).
Все эти штукуёвины давным-давно рулятся с компа при помощи специализированной софтины. Для хроматографов GE/Cytiva (вышеупомянутые äkta) она называется "Единорог", ну Unicorn тобишь. Через софтину можно контролировать текущие параметры (с какого входа сосёт, с какой скоростью, какой давляк и т.д.) и производить запись результатов. Блок детекторов после колонки даёт нам представление о том, что же там вообще творится (растворы имеют разную солёность, pH, поглощение ультрафиолета и т.п.), а программа записывает все эти показания в виде графика в зависимости от пропущенного объёма или времени - это называется хроматограмма. Без особого тайного знания (с) и/или поллитра в них, обычно, не разобраться. Ну вот, например...
По графику проводимости мы можем понять зашла/вышла соль на колонку, по графику поглощения УФ (чаще всего - 280нм, тут поглощает белок) мы понимаем, что попёр белок, по графику pH мы понимаем, что колонка уравновешена/не уравновешена/дошла кислота и щас попрёт белок и ещё куча-куча всего... Но, на самом деле, если процесс отлажен, то участие человека можно свести к абсолютному минимуму, прописав программу. Всё взаимодействие оператора с машиной будет сводиться к подключению нужного жбана к нужному порту, да тыканью в диалоговые окна (проверь, что раствор не кончился, подключи жбан-сборник и т.д.) - очень здорово влияет на повторяемость, а это - один из краеугольных камней производства.
Про железяки более-менее понятно. Аффинная хроматография замечательна тем, что даёт сумасшедший фактор очистки. На выходе мы получаем практически чистый раствор антитела (то что это именно то антитело, которое нам нужно, гарантируется на стадии культивирования - одна клеточная линия может производить одну молекулу и это проверяется при её характеризации/аттестации). Впрочем, полупродукт всё ещё может содержать нежелательные примеси (например, ДНК клеток хомячка, которые делали белок, белки этих клеток, налетевший с колонки белок А - тоже не очень полезная штука), кроме того, он может содержать слипшиеся вместе молекулы антител (аггрегаты) или, наоборот, развалившиеся молекулы (продукты деградации).
Для того, чтобы от них избавиться, существуют последующие этапы очистки. Кроме того, в полупродукте могут потенциально содержаться вирусы. Вирусы, которыми могли заболеть клетки. Да, клеточные банки характеризуют на отсутствие вирусов, да, их мониторят во время производства, да, в конце-концов, это грызунячьи вирусы, которыми человек не болеет, но кроме этого процесс очистки должен включать не менее 2 шагов, специально направленных на удаление возможных вирусов. Нужно доказать, что процесс очистки обеспечивает снижение вирусной нагрузки минимум на 15 логов (в 10 с 15 нулями раз), но это предмет совершенно другого разговора. От ДНК и белков клетки хозяина мы можем избавиться при помощи ионообменной хроматографии (в колонке тоже мармеладки, но не с белком А, а с заряженной положительно или отрицательно функциональной группой) - в зависимости от условий проведения хроматографии (прежде всего, pH и солёность раствора) мы можем сделать так, что либо продукт будет садиться на колонку, а примеси - нет, либо - наоборот. Первый способ называется bind-elute mode, второй - flowthrough mode. В последнее время пошла мода именно на Flowthrough хроматографию, т.к. количество примесей на данном шаге уже очень мало и для того, чтобы связать их все, не связывая продукт, достаточно относительно небольшой колонки, а это здорово экономит дорогущий сорбент и растворы при той же эффективности очистки. Так, для примера... в режиме bind-elute на литровую колонку можно посадить 20-30 граммов белка и потом его смыть. А в режиме flowthrough (связываем примеси) через ту же литровую колонку можно пропустить и 1000 граммов белка, потому что свяжет она те же 20-30 граммов, но примесей.
Продукты аггрегации и деградации, казалось бы, легко отделить при помощи гель-фильтрационной хроматографии, которая тупо делит молекулы по размеру. Проблема тут в том, что для хорошего разделения объём нанесения должен быть не больше 10% от объёма колонки (а у нас там пара сотен литров полупродукта стоит...), так что гель-фильтрацию оставьте аналитикам, в промышленном масштабе её никто не применяет (только если очень приспичит и другой возможности ну совсем нет). Поэтому используются другие сорбенты - тут может быть и гидрофобная хроматография (HIC) и ещё одна ионообменная (IEX) и всякие разновидности смешанной (MMC). Всё сугубо индивидуально и зависит от процесса. Что совершенно точно не применяется, так что обращёнка (RPC) и всякая страшная органика в качестве растворителей - только вода, только хардкор. Продукт слишком нежный.
После очистки, однако, раствор всё ещё не пригоден для введения пациенту (а это, кстати, либо подкожно, либо внутривенно. Привет всей гомеопатической нечисти типа оциллококцинума или как там его). В ход вступает последняя установка - тангенциальная фильтрация или TFF (Tangential Flow Filtration). Для неподготовленного глаза выглядеть может как какой-нибудь адронный коллайдер (впрочем, как и большинство других установок), например, вот так
Если не вдаваться в подробности, то работает она подобно почке (ну или гемодиализатору) - старый ненужный раствор отгоняется в слив, через мембрану, поры которой меньше белковой молекулы, постепенно замещается финальным, всё это дело концентрируется, чтобы не приходилось ставить капельницу с трёхлитровым баллоном и готово. Осталось только добавить вспомогательные вещества, чтобы белок при хранении не выпал хлопьями, стерилизовать и разлить по флакончикам.
Может показаться, что то, что я только что описал, где-то там, за гранью фантастики, однако это уже достаточно зрелая технология. На рынке существуют десятки препаратов этого класса и ещё сотни на подходе. Биотехнологические препараты сейчас определённо в тренде (из 10 мировых бестселлеров, наверное, больше половины - биотех) и за ними будущее. Впрочем, есть ещё препараты на основе РНК (но это тоже биотех) и индивидуальная медицина. Кстати, да... в России препараты этого класса тоже производятся. Даже не одной (и даже не двумя) компанией. Как дженерики (тут они называются biosimilar), так и оригинальные. Конечно, наш биотех не так массов, как европейский или американский, но он, если что, существует, существенен и развивается.
Бонусом для техногиков - автоматизированная упаковка промышленной колонки (похоже на трёхсоточку). Я с такой системой не работал, но масштаб суеты примерно понятен, хотя 300мм можно ещё упаковать вручную, как лабораторную. Дальше - 450 и больше, массы деталей растут пропорционально квадрату диаметра и без лебёдок или автоматизированной упаковки уже не обойтись
Точно не скажем, но в нашем проекте с этим можно справиться буквально за минуту одной левой!
В простонародье и терминологии это называется UV-VIS детекторы. Есть более сложная и функциональная вариация – DAD. Но о них ниже.
Принцип спектрофотометрии давно и хорошо известен, а методики с ее использованием и использованием спектрофотометров широко распространены, а сущность очень проста.
Если кратко, то практически все вещества так или иначе поглощают свет (как видимый, так и УФ, и ИК). Спектрофотометр (фотоколориметр, если мы работаем только с видимой частью спектра) содержит источник света. Обычно это вольфрамовая лампа с широким спектром излучения. Каким-либо образом из всего спектра отделяется нужная длина волны и определяется, насколько сильно свет на этой длине волны ослабляется, проходя через кювету с образцом. Сравнивая это ослабление (поглощение) с ослаблением при прохождении через чистый образец (референс или стандарт), можно определить концентрацию вещества в исследуемом растворе.
Если вы даже никаким образом не связаны с хроматографией, то спектрофотометр могли видеть. Они бывают всякие разные. Когда я учился, у нас на аналитике был такой:
Он просто крутил стрелкой туда-сюда, нам нужно было вручную рассчитывать концентрации. О, да, это было ОЧЕНЬ давно. Сейчас спектрофотометры куда круче. Они могут сканировать весь излучаемый спектр и определять поглощение на разных длинах волн. Могут рассчитывать концентрации на основании построенных пользователем градуировок и всё такое.
Принцип работы спектрофотометрического детектора в хроматографической системе точно такой же, разве что, сама конструкция чуть сложнее, а сам прибор более чувствителен. Хотя, последнее утверждение может быть не верным, если речь идет о самых современных и тонко чувствующих спектрофотометрах.
У меня почему-то нет фотографий наших детекторов. Как-то не сложилось их сфотографировать. Поэтому фотографии будут не мои.
Внешне наш спектрофотометрический детектор выглядит так:
Дизайн типичен для Shimadzu и выполнен в общем стиле со всеми блоками линейки. Блоки можно ставить друг на друга и собирать систему с несколькими разными детекторами. Это удобно. Все остальные производители придерживаются такой же схемы, хотя имеются и моноблочные системы.
За съемной панелью (правая часть, левая в целом выполняет декоративные функции) находятся два соединителя для входного и выходного каналов, а также собственно наружная часть проточной ячейки.
Проточная ячейка одновременно и крайне проста по устройству, а с другой стороны – это маленький шедевр точных технологий.
Я не смог найти крупной картинки внутреннего мира этого детектора, поэтому приложу маленькую, а дальше разберемся, что там внутри происходит.
А внутри происходит достаточно простой процесс: в детекторе установлены две лампы – обычная вольфрамовая и дейтериевая. Вот, так они выглядят:
Вольфрамовая (размер – около 30 мм с ножками):
Дейтериевая (вместе с цоколем она будет около 5 см длиной):
Несмотря на кажущуюся простоту, это очень дорогие запчасти. Их стоимости – несколько десятков тысяч рублей за одну лампу, а гарантированная наработка составляет 2000 часов (да, две тысячи часов). После этого уже не гарантируется стабильность излучения, поскольку со временем лампы деградируют и слабеют. Это приводит к ослабеванию выходного сигнала.
Итак, вольфрамовая лампа светит видимом диапазоне, а дейтериевая – в ультрафиолетовом. Это важно, поскольку мы хотим детектировать не только окрашенные аналиты (которых не так много, на самом деле), но и совершенно бесцветные и прозрачные. Но практически все вещества поглощают ультрафиолет и этим мы пользуемся.
В целом, и UV-VIS, и PDA детекторы устроены практически одинаково и работают на одном принципе – измеряют степень ослабевания света при прохождении через проточную ячейку какого-либо вещества.
Свет от ламп складывается, фокусируется через ахроматическую линзу на окошко проточной ячейки. Само окошко – это очень маленький стеклянный кружок. Размер его можно оценить в сравнении с листом бумаги формата А4. Окошко ячейки обведено жирной красным окружностью. Второй (потоньше) окружностью обведено посадочное место окошка, где можно рассмотреть очень маленькое отверстие. Вот, туда и должен попасть поток света. На выходе находится линза. Размеры всего этого можно оценить на втором фото.
Свет, попадая в проточную ячейку, где течет поток элюента с аналитами, уже разделенными на хроматографической колонке, либо проходит без изменений, либо, если на его пути попадается поток с растворенным аналитом, ослабляется (на самом деле, он всегда ослабляется, потому что большинство элюентов тоже поглощает ультрафиолет, но это ослабление учитывается и нивелируется, называется этот уровень интенсивности света базовой линией).
Чтобы было более понятно, я нарисовал принципиальные схемы двух детекторов (не бейте сильно, чукчу рисовать учили в детском саду, а потом забили):
Сверху схема UV-VIS детектора, где свет после дифракционной решетки проходит через оптическую щель, которая и выделяет из всего потока нужную нам длину волны. Поэтому на таких детекторах, как правило, работают на одной заранее установленной волне. Это выгодно, так как детектор стоит существенно меньше, а точность его весьма и весьма высока.
Такими детекторами комплектуются системы, на которых не предполагается проведение исследований научного характера, когда длины волн, на которых исследуемый аналит поглощает наиболее интенсивно, заранее могут быть не известны.
В противном случае нам пришлось бы гадать и после каждого неудачного выбора длины волны проводит разделение повторно.
Диодно-матричные детекторы (DAD или PDA – photo-diode array – в случае Shimadzu) работаю совершенно аналогично (нижняя часть картинки). Но свет после дифракционной решетки попдает не на оптическую щель, а на матрицу из фотодиодов (откуда и название). Матрица в целом аналогична таковой в фотоаппаратах и видеокамерах с той оговоркой, что чувствительна и к ультрафиолету.
Поскольку мы не отсеивали другие длины волн, получается интересный результат: мы видим поглощение НА ВСЁМ диапазоне волн от 190 до 800 нм. Мы можем ограничить диапазон длин волн, если точно знаем, что, например, УФ-область нам не потребуется или же потребуется только она, чем сократим объем генерируемых данных и можем даже отключать одну из ламп, если ее длины волн не нужны.
А так выглядит трехмерное отображение полученного спектра поглощения на некотором участке хроматограммы нескольких аналитов в одной смеси.
А так – сама хроматограмма (это не обязательно та же самая хроматограмма, но принцип и смысл те же) (и, да, далеко не все хроматограммы такие идеально чистые и с полным разделением пиков):
И пусть вас не смущает, что на схеме участки поглощения показаны в виде провалов на базовой линии, а на хроматограмме – в виде пиков. В случае спектрофотометрических детекторов программное обеспечение (если оно в курсе, что работает с ним), переворачивает хроматограмму и мы видим пики, как и положено.
Среди плюсов спектрофотометрических детекторов – их универсальность. Они пригодны для анализа практически любого вещества. А для многих из них, скажем, для фармпрепаратов в фармакопеях даже приводятся длины волн поглощения.
Кроме всего прочего, каждое вещество поглощает не на одной длине волны, а на некотором диапазоне или в нескольких участках спектра. И в случае с поглощением ультрафиолета спектр этого поглощения практически уникален для каждого вещества. Это позволяет использовать спектрофотометрический детектор не только для анализа уже известных веществ, но и в некоторых случаях выявлять неизвестное вещество по его спектру поглощения в УФ. Например, на картинке – спектр поглощения кофеина (правый верхний сектор):
Имея библиотеку спектров (или собрав свою), можно поиском по этой библиотеке с некоторой достоверностью определить неизвестное вещество. Другое дело, что библиотеки не всегда доступны и/или весьма дороги. Так еще и нужны далеко не всегда и далеко не всем.
Вот, наверное, сумбурно и непоследовательно получилось в общих чертах объяснить, как работает один из самых распространенных детекторов в хроматографии.
Есть масса других: рефрактометрические, флуориметрические, электрохимические, испарительные детекторы светорассеяния, хемилюминесцентные, масс-спектрометрические, конечно же. В газовой хроматографии – тоже целый набор свойственных только этому направлению детекторов.
Другими словами, практически все принципы получения сигнала от целевого аналита, которые доступны на сегодня, могут быть (и уже) реализованы в виде детекторов.
Если вас не утомляет техническая сторона, в следующий раз попробую написать о самом сердце любой хроматографической системы – колонке.
