Почти каждая клетка любого организма имеет собственные маленькие часики. Но что заставляет их тикать? Перевод статьи Фионы Кейс с сайта chemistryworld.com.Оригинал можно почитать туть. Ссылки на статьи в научных журналах и на некоторые термины добавлены мной. Поставил тег "Моё", т.к. перевод делал тоже сам.
Жизнь на Земле эволюционировала на планете вращающейся вокруг звезды. И организмы – от ранних цианобактерий и растений до человека – должны подстраиваться под ежедневные изменения температурного и светового режима дня и ночи. В эукариотических организмах (а мы с вами тоже относимся к ним) эти ежедневные циклы отражены в ядрах почти всех клеток. Колебательный характер производства и распада белков сохраняется приблизительно в течение 24-часового ритма – своеобразное тиканье молекулярных часов. У людей и других ведущих дневной образ жизни организмов с приближением дня начинается синтез белков, чтобы согреть нас и снизить порог пробуждения; все это приводит к тому, что мы просыпаемся, испытываем голод и полны сил для свершения новых дел. Белки, вырабатываемые в ночное время, обеспечивают понижение температуры тела, несмотря на то, что мы по-прежнему физиологически активны и отвечают за наш с вами сон. Потом цикл начинается заново.
Последовательность оснований в цепи ДНК, плотно упакованной в ядре клетки, кодирует последовательность подавляющего большинства белков когда-либо производимых организмом. То, какая молекула будет создана, определяется белковым катализатором – фактором транскрипции, который связывается с определенным участком ДНК и позволяет РНК-полимеразе создать копию последовательности. Эта матричная РНК (мРНК) в дальнейшем переносится в цитоплазму клетки, где и направляет синтез белка. Но откуда клетка знает когда и какой фактор транскрипции использовать? И как организован синтез белка в дневное и ночное время?
В 1971 году Сеймур Бензер – профессор Калтеха (США) и его аспирант Рональд Конопка обработали плодовых мушек этилметилсульфонатом, чтобы вызвать мутации в их ДНК. У них получились мутантные особи, которые вели себя так, будто бы они появились на различных планетах с периодами вращения 19 или 28 часов или же вовсе без какого-либо цикла смены дня и ночи [1]. Удивительно то, что всего лишь один ген - специфичная область ДНК – отвечает за такие изменения. Это был первый случай (даже ранее, чем физические характеристики, такие как цвет глаз или форма крыльев), когда поведение связали с генами. Но важность этой работы была оценена не сразу. Как отметил Майкл Росбаш в своей речи на вручении Нобелевской лекции по физиологии и медицине 2017, фундаментальную работу Бензера и Конопки цитировали всего 9 раз в следующее десятилетие после её публикации.
Это продолжалось примерно до открытия таких технологий как рекомбинантная ДНК и секвенирование ДНК, когда удалось обнаружить этот ген, названный period или per, а также белок связанный с ним – PER. Тогда-то и началось подробное изучение циркадных ритмов.
«В 1990 году Пол Хардин написал, возможно, самую важную статью [2], в которой показал, что белок PER вовлечен в обратную связь, которая регулирует колебания собственной мРНК»: говорит Росбаш. «Если вы повторите эксперимент с модифицированной мухой, отличающейся на одну аминокислотную последовательность в белке от своей дикой родственницы, то увидите, что максимальное значение концентрации мРНК достигается в течение 19 или 20 часов, а не 24. При этом поведение модифицированной мухи изменится соответствующим образом».
В этой статье не говорилось о транскрипции – исследователи предполагали, что белок PER может взаимодействовать с мРНК в цитоплазме, где он синтезировался. В последующих работах было указано, что PER направляется в ядро клетки; а также были обнаружены факторы транскрипции белка в ядре, которые он выключает. Среди них факторы транскрипции CLOCK и BMAL у млекопитающих, и CLOCK и CYCLE у плодовых мушек.
Белок PER участвует в саморегуляции синтеза самого себя. Ранним утром он начинает накапливаться в цитоплазме, откуда переносится в ядро и начинает блокировать собственный фактор транскрипции. Весь процесс занимает 24 часа.
Таким образом, можно в общих чертах описать механизм внутренних часов. В течение нескольких часов в утреннее время начинается синтез и накопление в цитоплазме белка PER. Когда концентрация протеина возрастает, он начинает транспортироваться в ядро, достигая максимального значения ближе к ночи. В ядре он связывается и деактивирует собственный фактор транскрипции, тем самым останавливая синтез мРНК и выключая все дальнейшее производство. Затем, в течение нескольких часов происходит разрушение и выведение белка PER из ядра, до тех пор, пока снова не запустится синтез мРНК, чтобы накапливать PER в цитоплазме для следующего дня.
Эта негативная обратная связь является сердцем контроля циркадных ритмов, которые связаны с транскрипцией и продуцированием 10-20% всех белков клетки многих организмов, от млекопитающих до растений и насекомых.
Внешнее проявление циркадных ритмов очевидно – мы спим и просыпаемся, поддерживаем или теряем концентрацию, изменяем температуру нашего тела и регулярно принимаем ванну. Также ясны эволюционные и социальные выгоды от таких ритмических изменений. Поскольку ведущие дневной образ жизни организмы синхронизированы с движением планеты, то, например, мы - люди – стараемся более плодотворно использовать дневное время и использовать ночное время для восстановления клеток и регулирования памяти. Эта синхронизация помогает нам жить группами, когда каждый делает свою работу в одно время суток. Но самым ранним и наиболее важным применением циркадных ритмов является регулировка химии.
«Компартментализация клетки – наиболее важный шаг в эволюции – появление отдельных участков, способных осуществлять различные биохимические функции, и разделенных мембранами, через которые могут проникать реагенты и продукты» - объясняет Рассел Фостер – «Развитие временного разделения было не менее важно. Различные этапы метаболизма, например, окислительные и восстановительные реакции должны протекать в различное время».
Концентрация метаболитических гормонов, таких как глюкагон и инсулин варьируется в течение дня в ожидании еды. Различие внутренних циклов дня/ночи влияют на редокс состояние в клетках сердца путем модуляции ионных каналов, и вызывают изменения в состоянии мозга, которые позволяют нам укреплять воспоминания ночью.
В 1998 году Уэли Шиблер со своей группой исследователей обнаружил, что мышиные фибробласты, замороженные на 25 лет, все ещё были способны экспрессировать циркадные ритмы находясь при этом удаленными от других клеток, которые могли бы подавать им какие-либо сигналы. [3] Вскоре стало очевидно, что часовой механизм существует во всех клетках. Тиканье этих мириад часов упорядочено при помощи небольшой группы в 20 000 нейронов в супрахиазматическом ядре (СХЯ) – небольшом участке мозга, расположенном близко к волокнам зрительного нерва — непосредственно над перекрёстом зрительных нервов.
Фостер был первым, кто использовал аналогию с оркестром: « СХЯ – это дирижер, сохраняющий определенный порядок и время игры различных инструментов, только вместо нот они используют нить ДНК. Если вы застрелите дирижера, то все пойдет не так. Вы услышите какофонию вместо симфонии».
Но эти часы могут изменяться. Чтобы выровнять свои внутренние процессы в зависимости от сезонных изменений длины дня и ночи, животные должны перевести свои внутренние часы на новый цикл. Путешественники в разные части света аналогичным образом перестраиваются к новым временным зонам.
Свет – наиболее важный экзогенный фактор служащий для увеличения или сокращения циркадных ритмов. Без нормального суточного цикла дня и ночи внутренние часы сбиваются. Ритмы сохраняются, но они отклоняются от 24-часового цикла. Различные «бункерные» эксперименты, в которых добровольцы жили в «безвременных» условиях с постоянным световым и температурным режимом и нерегулярным питанием, показали, что через некоторое время они начинали жить по более длинному графику. Без постоянной синхронизации большинство из нас начнут просыпаться все позже и позже.
Исследования лаборатории Фостера показывают, что критическим показателем является свет. «В сумерках световые импульсы сигнализируют о продолжении дня, что в свою очередь заставляет часы СХЯ задержать адаптацию к этому изменению. Но, в конце ночи, преждевременный свет сигнализирует о начале дня, часы реагируют, продвигая свою фазу» - объясняет Фостер. «Это вызов для подростков, которые часто любят посидеть до позднего вечера, но редко встречающих рассвет!»
Первоначально предполагалось, что сигналы, которые действуют на СХЯ у млекопитающих, поступают от палочек и колбочек. Но исследования, проведенные в конце 1990-х годов, показали, что мыши, у которых отсутствуют фоторецепторы, прекрасно справляются и без них и сохраняют способность синхронизировать циркадные ритмы в соответствии с уровнем освещенности. «Когда глаза закрыты, способность реагировать на свет теряется, так что должны были быть какие-то другие фоторецепторы внутри глаз»: отмечал Фостер.
Ганглиозные клетки получают информацию от клеток-фоторецепторов – палочек и колбочек – и посылают сигнал дальше в мозг, который затем интерпретируется в визуальную информацию. Но, некоторые из этих ганглиозных клеток (1 – 2%) сами обладают фоточувствительностью. Они содержат пигмент – белок меланопсин – который способен реагировать на свет и тьму (благодаря ему зрачок сужается и расширяется в ответ на свет/тень) и посылает информацию к СХЯ. Это и были потерянные рецепторы.
«Когда свет необходимой длины действует на меланопсин, запускается последовательность сигналов, приводящих к повышению уровня ионов Ca2+ и 3’,5’-цикло аденозинмонофосфата (цАМФ) внутри нейронов СХЯ» - объясняет Фостер. "Это запускает фактор транскрипции белка, который повышает уровень мРНК протеина PER, что приводит к повышению его концентрации”.
Но все механизмы, которые уравновешивают количество PER в клетке, все еще работают, поэтому усиление длится недолго. “Именно поэтому мы испытываем джетлаг: наши часы не могут тут же настроиться на новый цикл рассветов-закатов, потому что есть системы тормозящие этот переход ”.
Другая поразительная особенность 24-часового колебания метаболитических процессов, так это тот факт, что ритм продолжается, без изменений, несмотря на изменения температуры.
Часы, которые участвуют в открытии цветков на рассвете, оказались бы просто бесполезны, если бы процесс замедлялся при понижении температуры. Даже у теплокровных животных существует разница температур между кожей и внутренними органами. Если бы синхронизация метаболических процессов в клетках зависела от их местонахождения или от состояния погоды за окном – наступил бы хаос.
Эта независимость от температуры была основным камнем преткновения в принятии ранней теории часового механизма (в отличие от синхронизации только по внешним признакам день/ночь). Биологические реакции точно так же подчиняются уравнению Аррениуса, как и любые другие химические реакции, и до недавнего времени никто не мог дать ответ, почему часы не ускорялись при повышении температуры.
Недавняя работа Хироки Уэды [4] из Токийского университета приоткрывает завесу тайны: поскольку белок PER необходим для ингибирования часовых протеинов — превращения дневного времени активности в ночной отдых - уменьшение количества PER будет замедлять часы. Большинство белков клетки обладают небольшим временем жизни. Они становятся нестабильными, утрачивают структуру как только выполняют свою роль в биохимических процессах и отправляются на переработку. Как оказалось, повышение температуры компенсируется дестабилизацией соответствующего количества белка PER.
Чтобы понять эту изысканно сбалансированную химию, необходимо ввести еще одного персонажа — семейство энзимов казеин киназа 1. Словно винтик в часовом механизме казеин киназа 1 переносит фосфатную группу от аденозинтрифосфата (АТФ) к PER. Перенесенный заряд дестабилизирует молекулу PER и делает её уязвимой для убиквитинирования и удаления.
«Нами было показано, что существует два механизма, замедляющих фосфорилирование протеина PER при повышении температуры» — рассказывает Уэда — «Сродство комплекса энзим-АТФ к такому субстрату, как PER, понижается при повышении температуры. Молекулярная динамика предполагает, что это является следствием большого числа колебаний формы катализатора, что и препятствует связыванию с субстратом». Также, тормозящий эффект наблюдается и с другой стороны. «Сродство продукта энзим-АДФ возрастает. И эти два механизма, действующие на разных участках, обуславливают температурную компенсацию реакции фосфорилирования белка PER и тем самым регулируют точность часов».
Примечательно, что сложный, но надежный феномен температурной компенсации регулируется несколькими фосфатными группами и простыми изменениями электростатического заряда.
Циркадные системы, по большому счету, являются феноменом химической природы, поэтому большинство текущих работ посвящены изучению явления на молекулярном уровне. Хорошей точкой отправления являются наиболее простые часовые механизмы.
Цианобактерии имеют очень простой механизм молекулярных часов — всего три белка участвуют в его деятельности.
Циркадные ритмы возникают в ответ на свет. 500 миллионов лет назад цианобактерии эволюционным путем приобрели внутренний часовой механизм, позволивший одноклеточному организму предчувствовать восход солнца и тем самым защитить собственную ДНК от повреждающих УФ лучей. Цианобактерия отмеряет время используя три взаимосвязанных протеина— KaiA, KaiB и KaiC. Их самосборка изменяется, поскольку протеин KaiC фосфорилируется в течение дня и дефосфорилируется в ночное время. Это изменяет активность факторов транскрипции и набор белков, которые будут синтезированы клеткой. Но что же измеряет время — почему этот процесс занимает 24 часа?
Текущие исследования Энди Ли Ванга и Кэрри Партч объясняют молекулярные изменения, контролирующие внутренние часы. [5] «Данные, полученные благодаря масс-спектрометрии меченых атомов, показывают, что протеин KaiB подвергается медленному рефолдингу приводящему к активации белка из инактивированного состояния» — рассказывает Партч, — «Нам удалось кристаллизовать версию белка «застывшую» в переходном в активную форму состоянии, что позволило нам увидеть взаимодействие между тремя белками друг с другом в их ночной форме. Это важно, поскольку проливает свет на то, как разные белки конкурируют за одни и те же интерфейсы». Это конкурентное связывание, наряду с медленным рефолдингом KaiB и быстрым переключением KaiA, позволяет внутренним часам измерять время между восходом и закатом.
При дальнейших поисках Партч удалось обнаружить еще несколько белков вовлеченных в работу циркадных часов. «Когда люди пытаются кристаллизовать белок они часто обрезают неупорядоченную часть, но все веселье именно в активной части белка» — говорит Партч. «Если вы анализируете два похожих варианта белка BMAL, один из которых участвует в циркадных ритмах (BMAL1), а второй — нет (BMAL2), и меняете их части, то можете узнать, какие участки ответственны за циркадные часы. Есть что-то особенное в нескольких ключевых регионах в неупорядоченном хвосте BMAL1, который играет важную роль в синхронизации внутренних часов.
Модель, которой можно объяснить молекулярное взаимодействие сводится к следующему: белок с неподвижной частью — основа, содержащая структуры, которые позволяют белку CLOCK связываться с BMAL, и распознавать и соединяться с ДНК. Вторая часть этого белка должна быть более подвижной и она вносит вклад в синхронизацию часов. «Статичная часть прикрепляется к необходимому месту в ДНК и начинает транскрипцию определенного гена, но наиболее интересная часть — там, где у вас есть контроль — это подвижные части»: говорит Партч. Возможно, неудивительно, что белок PER, играющий огромную роль в циркадных ритмах, наиболее неупорядочен. Как говорит Партч: « Он состоит из более чем 1200 аминокислотных остатков, 800 из которых, предположительно, неупорядочены».
За последние 45 лет изучения циркадных ритмов биологи прорубили маленькое окно в понимание механизмов жизни и показали глубокую связь между нашими внутренними процессами и ритмом вращения планеты. Нобелевской премией 2017 года были отмечены ранние исследования фундаментальных основ производства и разрушения белка, обеспечивающих одну из самых ключевых саморегулирующихся обратных связей. Современные инструменты молекулярной биологии позволили обнаружить ещё больше молекул принимающих участие в регуляции циркадных ритмов, отмеряющих день за днем и смену времен года. Новые исследования будут раскрывать химизм процессов — реакции, молекулярные изменения, конкурентное связывание и диффузию — что раскроет их поведение.
«Мы поймали ритм, поняли, кто дирижирует и мы начали читать ноты. Понимание на молекулярном уровне покажет нам, как играют инструменты — и кто знает, какие вариации мы будем сочинять для симфонии жизни?" — говорит Рассел.
